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背景简介

Ⅰ型糖尿病是一种长期代谢性疾病，对人类健康构成重大威胁，全球患病率不断增加。最近，治疗方法集中在通过胰腺β细胞置换内源性胰岛素合成，而不是提供外源性胰岛素，但是通过移植β细胞会受到免疫排斥反应的限制。为了解决这个问题，开发了用于β细胞包封和免疫分离的生物材料，从而改善β细胞移植带来的问题。但是目前大多数封装无法模拟天然胰岛微环境和缺乏空间结构设计，阻碍了营养物质、氧气和胰岛素的有效转移。

为此，东南大学李玲教授团队，采用微流控方法制备了具有多孔结构的微凝胶，包封用于糖尿治疗的β细胞和骨髓间充质干细胞（MSC），协同治疗糖尿病。植入了包封β细胞和间充质细胞的多孔微球，缓解了高血糖并保持血糖水平的动态平衡。相关研究工作以“Mesenchymal Stem Cell-Laden Composite β Cell Porous Microgel for Diabetes Treatemnt”为题发表在《Advanced Functional Materials》期刊上。

研究内容

01

微流控方法制备多孔微凝胶

图1 多孔微球的表征

具有多孔结构的微球是由明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）和聚环氧乙烷（PEO）两种材料构成，GelMA为微球的主要结构材料，PEO为制孔剂。通过玻璃毛细管微流控技术，内相为含有细胞的GelMA和PEO预凝胶溶液的混合物，外相为含有Span 80的石蜡油如图1a所示。经过紫外线聚合后，去除掉制孔剂PEO，可以得到具有多孔结构的微球。扫描电子显微镜可以看出微球表面的多孔结构如图1b，c。通过改变毛细管的直径和液体流速可以制备多种不同粒径的微球如图1d-i。

02

多孔微球的表征

图2 多孔微球的孔隙率、溶胀率和降解的表征

微球在紫外交联后，通过浸泡在PBS溶液中24h除去PEO，来实现制备互相连接的孔隙。首先探究了预凝胶溶液中的GelMA和PEO组成比率，对微球中孔隙的影响。探索了体积比从1：1到4：1（GelMA：PEO），随着体积比的增加，得到微球孔径逐步减小，尺寸分布逐步变窄如图2a-c。之后根据包封要求，将体积比为1：1的GelMA-PEO预凝胶溶液进行后续的研究。多孔结构可以保持微球的溶胀能力，浸泡在PBS中前2小时内，溶胀率显著增加如图2d。并且GelMA-PEO水凝胶微球表现出了非线性应力-应变响应如图2e。研究具有多孔结构微球的渗透性时，将罗丹明B和BSA-FITC分别模拟小分子物质和大分子物质，两种物质从周围环境中迅速扩散到了多孔的微球中，在不同的时间点的荧光强度显示了罗丹明B比BSA-FITC更多地穿透多孔微凝胶中，并且两种物质均在10s左右就可以达到扩撒平衡如图2f、g，表明具有孔多结构的有利于包封细胞的营养和氧气的扩散。

03

多孔微球封装细胞保持其活力及功能

图3 封装细胞的存活率及β细胞胰岛素的分泌

通过微流控技术直接将β细胞和间充质干细胞封装在多孔微球中后，观察细胞活力，可以看出封装7天后细胞活力不变，并且进行了一定的增殖如图3a，接下来为了进一步研究证明多孔微球的对多种细胞的包封后活力的影响，运用Dil和Dio两种细胞染料标记不同种细胞，发现β细胞和MSC均有一定的增殖，并且具有一定形成团簇的趋势，进一步定量分析了7天内包封细胞的活力和荧光强度，表明细胞增殖良好如图3b-d。为了验证包封后，细胞仍具有相应功能，通过钾刺激胰岛素分泌测定检查体外胰岛素分泌，结果发现在高钾离子浓度条件下多孔微球包封β细胞和MSC的组别相比于单纯β细胞和微球包封β细胞两组，具有更高的胰岛素分泌水平。这是因为两种细胞的相互作用及多孔微球对胰岛素的良好渗透性。这些证明了多孔微球为β细胞和MSC提供了适宜的微环境，有助于它们的存活和增殖，为进一步治疗糖尿病奠定了基础。

04

体内实验

图4 包封β细胞和间充质干细胞多孔微球用于治疗糖尿病的体内验证

接下来证明包封β细胞和MSC多孔微球治疗效果。移植后检测小鼠的血糖水平和体重情况来分析移植功能，结果表明多孔微球包封MSC和β细胞的组别能使糖尿病小鼠高血糖状况得到缓解，体重也逐渐恢复；单纯包封β细胞的组分血糖仅有较低的降低但仍处于高血糖水平；移植MSC和β细胞的组分血糖在短时间下降后，又恢复到高血糖状态；其他组别都表现出血糖水平升高，体重减轻的表现如图4c、d。移植120天后进行葡萄糖耐量实验，确定对葡萄糖浓度变化的胰岛素分泌能力，注射后，多孔微球包封的MSC和β细胞组能使葡萄糖耐量冲分恢复如图4e、f。对小鼠血糖的监测结构表明，多孔微球包封MSC和β细胞移植到体内后可以长时间控制血糖。

05

组织学分析

图5 糖尿病小鼠植入物组织学分析

为了进一步评估多孔微球封装MSC和β细胞植入后的炎症情况，进行了H&E染色。结果显示，植入后没有明显炎症反应，与对照组基本持平，并能看出微球内包封的MSC和β细胞。而直接植入细胞组发现了大量由炎症引起的细胞浸润如图5a。用免疫荧光标记巨噬细胞和T细胞，也可以看出包封MSC和β细胞的多孔微球组几乎没有检测到细胞的沉积。因此结果表明，含有MSC和β细胞的多孔微球具有较低的免疫应答和良好的生物相容性。

总结

该研究提出的多孔微凝胶包封MSC和β细胞用来治疗糖尿病，水凝胶可以提供隔离保护作用，保护封装细胞免受机体免疫细胞的攻击，多孔微凝胶结构可以进一步增强物质交换效率，MSC和β细胞复合，MSC细胞可以进行免疫调节，进一步降低植入后的免疫反应，保护β细胞长期发挥调节血糖的能力。表明多孔微凝胶封装MSC和β细胞在糖尿病治疗领域具有巨大应用潜力。

智能材料与再生医学实验室

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分享人：李瀚庭